结核杆菌（TB）检测及基因耐药分析

（一）结核分枝杆菌（TB）检测背景：

     现代抗生素的广泛使用丰富了环境中微生物的耐药性机制，致使抗生素耐药性基因（ARGs）相继出现并迅速传播，时至今日，抗生素耐药生物（ARGs）已成为全球公共卫生关注的一个重要问题，世界卫生组织将抗生素耐药性描述为当今传染病面临的最大挑战，无论是国内生产总值高还是低的国家都面临同样的威胁。一项来自欧盟的数据分析估计，2015年有超过60万例感染和3.3万人死于耐药微生物（ARGs），与2007年的类似估计相比，这一数字增长了近2.5倍。因此为了对抗全球抗生素耐药性的威胁，快速确定AROs和ARGs的特征、监控它们在空间和时间上的分布、识别新的ARGs和抗性途径显得格外重要。

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（二）详细资料：

结核病（TB）是全球及我国严重的公共卫生问题，耐多药结核病和广泛耐药结核病是目前临床亟待解决的难题之一。因此，快速、准确地检测标本中耐药结核分枝杆菌（MTB），快速诊断耐药结核病（DR-TB），对有效控制DR-TB疫情是至关重要的。

当前结核病耐药情况如何？ 

根据世界卫生组织报道，结核病耐药情况十分严重，2016年全球新发TB患者1040万，130万人死于TB；60万新发TB患者耐利福平（RR-TB），其中49万是耐多药结核病（MDR-TB）患者，MDR/RR-TB在新发TB患者中的发生率约4.1%，在已治疗患者中约19%；MDR-TB患者中XDR-TB占6.2%。

耐药TB病例47%发生于印度、中国和俄罗斯。2016年我国新发TB患者89.5万，MDR/RR-TB发生率是5.2%。因此，耐药TB尤其是MDR-TB、广泛耐药结核病（XDR-TB）的快速诊断和有效治疗是当前TB防控中亟需解决的难题。

1.我国TB患者中，RFP耐药90%～95%是由于rpoB突变所致，其中531位、526位和513位密码子突变通常导致大多数结核菌对RFP、RFT高水平耐药，而对RFB高水平和低水平的耐药各占一半；514和533位密码子突变一般导致低水平耐药；508位和509位氨基酸置换已证实与耐RFP无关。RFP分子药敏检测结果与表型药敏试验结果具有较好的一致性，RFP与RFT和RFB有70-90%的交叉耐药率。因此，RFP耐药一般不主张更换为RFT，是否更换为RFB需根据表型药敏结果确定，RR-TB通常采用二线抗结核药物治疗。

2.我国TB患者中，INH耐药70%～80%是由于katG315位密码子突变所致，应认识到该突变只是导致katG酶活性降低，但仍能催化INH转换为其活性型异烟酸而发挥抗结核作用，只是转换效率降低，表型药敏试验通常表现为结核菌对INH低水平耐受或敏感，建议临床上加大INH剂量或加用PAS或更换为PAS-INH或PTO或ETO。10%左右患者Mtb katG完全缺失，一般会导致高水平耐INH，继续应用INH治疗效果不理想，建议更换为PTO或ETO。10％左右患者结核菌菌株inhA-15位核苷酸突变，表型药敏试验通常表现为结核菌对INH、PTO、ETO低、中或高水平耐受或敏感。因此，inhA-15位突变会导致INH与PTO、ETO有一定的交叉耐药性。

3. 我国TB患者中，大多数EMB耐药是由于embB基因突变所致，47％～89％发生在306位密码子。EmbB306位氨基酸置换通常导致结核菌对EMB中等水平耐药，但临床上适度增加EMB的剂量仍有效。因此，建议常规的EMB药敏试验结合embB306基因检测，以指导EMB剂量的调整。

目前结核菌已发现的常见耐药基因突变有哪些？

1．利福霉素类药物：利福平（RFP）、利福喷丁（RFT）和利福布丁（RFB）均为一线抗结核药物，其作用靶标RNA聚合酶α、β、β'亚单位编码基因rpoA、rpoB、rpoC突变均可能导致Mtb对其耐受。其中95%左右的突变发生在rpoB507至533位氨基酸密码子，最常见的突变位点是531位和526位氨基酸密码子。

2．异烟肼及异烟酸衍生物：结核菌耐异烟肼（INH）主要与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因（katG）缺失或突变以及烯酰基运载蛋白还原酶的调控基因（inhA）突变有关；KatG315位密码子和inhA-15位是最常见突变位点。而异烟酸衍生物丙硫异烟胺（PTO）和乙硫异烟胺（ETO）耐药主要是由于参与分枝菌酸合成的inhA编码基因和启动子区域及其激活剂单氧酶编码基因ethA突变所致。

3．乙胺丁醇：结核菌耐乙胺丁醇（EMB）与阿拉伯糖基转移酶编码基因embA、embB和embC表达增高或突变有关，其中embB306位密码子是最常见突变位点。

4．吡嗪酰胺：结核菌耐吡嗪酰胺（PZA）主要是由于吡嗪酰胺酶编码基因pncA、核糖体蛋白S1编码基因rpsA和天冬氨酸脱羧酶基因panD突变所致，其中pncA编码基因突变是最常见原因，相对热点区域位于3～17、61～85和132～142位密码子。但应注意的是，部分pncA突变与耐药无关。

5.链霉素：结核菌耐链霉素（SM）是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16S rRNA编码基因rrs突变所致。RpsL43位和88位密码子及rrs905位和513位核苷酸是最常见的突变位点。

6．喹诺酮类药物：结核菌耐喹诺酮类药物主要是其DNA旋转酶的A亚单位编码基因gyrA或B亚单位编码基因gyrB突变所致，其中gyrA67～106位密码子是结核菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）。

7. 卡那霉素、氨基羟丁基卡那霉素A、卷曲霉素和紫霉素：结核菌耐卡那霉素（KM）、氨基羟丁基卡那霉素A（AK）、卷曲霉素(CAP)和紫霉素（VIO）主要与rrs基因突变有关，其中A1401G置换是最常见的突变。此外，rRNA转甲基酶编码基因tlyA（rv1694）突变也会导致CPM和VM耐药。

8. 贝达喹啉和氯法齐明：Rv0678和pepQ(rv2535)基因突变均会导致结核菌对贝达喹啉(BDQ)和氯法齐明(CFZ)低水平的耐受，使两者产生交叉耐药性。此外，rv1979c突变也会导致结核菌耐受CFZ。

9.PA-824和德拉马尼：结核菌耐受PA-824和德拉马尼主要是由于F 420依赖的生物激活途径中的下列5个基因突变所致：硝基还原酶基因ddn、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因fgd1、2-磷酸-L-乳酸转移酶基因fbiA、fbiB和7,8-二脱甲基-8-羟基-5'脱氮核黄素-5'-磷酸盐合成酶基因fbiC。

10.大环内脂类药物：结核菌耐大环内脂类药物可能与其存在单甲基化转移酶ermMT（rv1988）和膜外排泵编码基因Tap(rv1258)有关，使其对该类药物呈天然抗性。

11. 环丝氨酸：结核菌耐环丝氨酸（CS）可能与谷氨酸脱羧酶编码基因gadA、D-丙氨酸消旋酶编码基因alrA(rv3423c)、D-丙氨酸连接酶编码基因ddlA(rv2981c)和L-丙氨酸脱氢酶编码基因ald(rv2780)突变有关。

如何检测结核菌是否耐药？

目前主要采用下列两种方法：表型药敏方法和分子药敏方法。

表型药敏方法是建立在培养基础上的，通过观察结核菌在含药培养基中的生长情况来检测其耐药性,是目前耐药检测的金标准。由于结核菌慢生长的特性决定了该方法需较长时间，但其可检测较多种类药物的耐药性。

分子药敏方法是采用分子生物学技术检测、鉴定结核菌的耐药基因突变型。分子检测的优点是可快速、灵敏地从临床标本中检出耐药结核菌，甚至涂阴、培阴的标本，但检测的药物种类有限。目前任何单一的药物敏感性检测方法并不能完全满足临床需求，通常可检测十几种药物的表型药敏方法与快速检测部分药物耐药基因型的分子药敏方法相结合，优势互补，为临床快速诊断和有效治疗耐药TB提供实验依据。

（三）检测项目：

（四）检测意义：

1.可快速定性检测结核杆菌感染情况，为治疗争取时间，减少新的耐药菌产生。结核杆菌因其培养周期长，临床很难采用培养方法进行结核杆菌感染的快速诊断，而采用基因芯片法，则可以做到这一点，如通过对痰、血液、淋巴液、脑脊液、胸腔积液、腹水等标本中结核杆菌的基因芯片检测，可快速诊断肺结核、结核杆菌菌血症、淋巴结合、结核性脑膜炎、结核性胸腹膜炎等。

2.一次检测辅助多种药物选择，降低患者用药负担。

3.能尽早确定病原体的耐药特性，对控制疾病发展、提高治愈率有潜在的价值。

4.有助于抗结核治疗的监测，在抗结核治疗中，采用基因芯片方法定期检测，可评价抗结核药物的疗效。
5.要注意临床“假阳性”问题，基因芯片检测的是病原体核酸，不管结核杆菌是否为活细菌，基因芯片均能检出，在经抗生素治疗一个疗程后，建议两周后再做基因芯片检测，以避免临床假阳性。

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