资讯 | 科研人员揭示DNA糖基化酶在核小体上的碱基切除机制

2023-07-18 09:07:19 14

北京大学生命科学学院高宁教授课题组在Cell Discovery上发表了题为“Structural and mechanistic insights into the DNA glycosylase AAG-mediated base excision in nucleosome”的研究论文。论文利用冷冻电镜技术阐明了DNA糖基化酶(DNA glycosylase)在核小体(Nucleosome core particle,NCP)不同位置上的碱基切除机制。

真核生物的碱基切除修复(Base excision repair,BER)可以定位和修复染色质中的DNA损伤。基因组DNA中含有大量外源损伤剂诱导和自发分解反应造成的DNA碱基损伤。DNA糖基化酶可以识别并切除损伤的DNA碱基,生成一个无嘌呤/无嘧啶的位点(AP site),这个位点可以被核酸内切酶APE1切割并在DNA上产生一个缺口。随后的修复过程可以通过DNA聚合酶、DNA连接酶以及相关蛋白质因子通过两种途径修复(Short-patch and long-patch BER pathways)。

烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG(3-methyladenine DNA glycosylase)可以识别包括3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA),7-甲基鸟嘌呤(7-methylguanine,m7G),氧化腺嘌呤1,N6-乙醇腺嘌呤(1,N6-ethenoadenine, εA)和脱氨腺嘌呤次黄嘌呤(Hypoxanthine)在内的碱基损伤。在人类中,AAG的表达改变与微卫星不稳定性、自发移码突变和多种癌症有关。在小鼠模型中,AAG敲除小鼠容易发生肝癌和结肠直肠癌,而在AAG过表达的小鼠中,过度的AAG活性会导致肝毒性、致死和其它烷基化诱导毒性。

DNA的碱基损伤可以发生在染色质化的真核生物基因组的所有区域,包括核小体DNA位点。核小体作为天然的屏障会阻碍BER相关蛋白对损伤位点的接触,只有一部分面向溶剂侧的DNA自由暴露。广泛的体外研究表明,BER因子可以选择性地定位并结合到核小体中的不同损伤位点。一般来说,AAG在某一位点的活性和该位点的可接触性正相关,研究证实与组蛋白核心区域相互接触的DNA具有更高的突变率,这可能由于BER因子与损伤碱基低的接触性密不可分。在结构上,损伤碱基的可接触性取决于其在核小体上的平移位置和旋转方向,面对溶剂的损伤碱基确实比封闭和嵌入的损伤碱基更容易被修复。以往的结构研究主要聚焦在DNA糖基化酶对裸露DNA上的修复机制,但这些蛋白质如何克服核小体施加的障碍来定位和修复核小体中的DNA碱基损伤尚不完全清楚。本研究将模拟损伤的碱基(Deoxyinosine,DI)设计在核小体DNA的不同位置上,包括不同的超螺旋(Superhelical locations,SHLs)和旋转方向上(图1a),这些位置分别代表了不同的SHLs上相似性的位置(-30、-50)和同一个SHL上不同旋转方向上导致的溶剂可及性不同的位置,包括完全暴露(-50),封闭(-53)和嵌入(-55)的位置上。通过冷冻电镜技术分别解析了四种包含损伤碱基的核小体结构(Apo-state)以及核小体和DNA糖基化酶AAG的复合物结构(Post-catalytic state)。

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图1 AAG-NCP-30AP复合物示意图

结构分析表明在线性或者核小体DNA底物上,AAG都使用一组同样的保守氨基酸残基进行相互作用,并且作用模式比较相似(图1b—g)。重要的是,通过与不包含DI的NCP结构比较,作者发现仅存在一个DI核苷酸就足以全面扰动核小体DNA的结构,导致核小体DNA和组蛋白核心之间的包埋表面积减少,并且无论受损碱基的位置如何,这些核小体DNA的整体扰动都处于相似的模式:由DI引起的DNA形变在核小体DNA出口附近最为明显。

进一步的结构分析发现,在形成的稳定AAG-NCP复合物中(包括-30、-50、-53),NCP的损伤位点都已变成了APsite,处于催化后状态(post-catalytic state)。在这些AAG-NCPAP复合物中,AAG的结合导致受损碱基周围的核小体DNA发生非常显著但相对局部的扭曲,根据受损部位的平移和旋转位置,AAG利用不同的机制接触损伤的碱基。(1)对于具有高溶剂可及性的完全暴露的DNA损伤碱基,AAG具有很高活性,能直接接触这些损伤碱基,在结构上直接增加DNA的局部扭曲以识别损伤位点(图2a)。(2)对于具有中等溶剂可及性的封闭的DNA损伤碱基,AAG的活性相比于完全暴露位置的AAG活性低,AAG诱发剧烈的局部的DNA扭曲,并且为了接触到修复碱基,还需要DNA的旋转和包含约1bp的位移去缓解核小体的造成空间障碍(图2b)。(3)对于溶剂可及性极低的深埋位置的DNA损伤碱基,局部DNA扭曲和有限的核小体DNA位移不足以完全暴露埋藏的碱基。此时,被DI整体扰动的核小体可能更容易自发展开(nucleosome breathing),AAG可以利用这一特性来捕获分离的末端dsDNA并使这一过程不轻易可逆。因此,在这些完全深埋的位点中,核小体DNA的部分开放可能是AAG的招募和催化的先决条件(图2c)。

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图2 AAG介导的核小体碱基切除的示意图

综上所述,本研究解析了包含不同位置损伤的核小体结构以及核小体和DNA糖基化酶AAG的结构,揭示了碱基损伤对核小体稳定性的影响,为理解DNA糖基化酶AAG如何利用核小体的结构动力学参与核小体中的DNA碱基损伤修复提供了一个机制框架。在更广泛的背景下,这些数据也有助于理解其它的DNA结合蛋白如何调控核小体的结构动力学来发挥其分子功能。(来源:生物谷