前沿 | 华中农大彭楠团队开发首个来自古菌的TnpB微型基因编辑工具

基于CRISPR-Cas9或Cas12a的基因编辑工具已经得到广泛应用，成为推动生命科学、现代农业、医学和合成生物学等领域快速发展的重要动力。但是，基因编辑工具的应用仍面临巨大挑战。例如， 由于Cas9及Cas12a核酸酶系统分子量巨大（通常大于1000个氨基酸），限制了递送效率等。更重要的是，由于缺乏CRISPR-Cas9及Cas12a的底层知识产权，基于该系统的基因编辑技术成为我国基因编辑应用的“卡脖子”技术难题。

2023年11月11日，华中农业大学彭楠教授课题组在 Cell Discovery 期刊发表了题为：Reprogramming an RNA-guided archaeal TnpB endonuclease for genome editing 的研究论文。

该研究开发了全球首个来自古菌域的RNA引导的微型编程性核酸酶系统——SisTnpB1，可在多种不同生长温度的微生物中实现高效基因编辑，有望为现代生物育种提供自主知识产权的高效基因编辑工具。

目前，所有Cas9及Cas12a等编程性核酸酶均来自细菌。而古菌编码的编程酶没有得到有效发掘。

在这项研究中，彭楠教授课题组从古菌Sulfolobus islandicus REY15A中鉴定了23个IS200/605家族编码的TnpB编程酶性核酸酶。该酶具有分子量小（40 kDa）、与已报道的RNA引导的编程性核酸酶同源性低（<30%）等特点，具有开发成自主知识产权基因编辑工具的巨大潜力。

研究团队通过生信分析，准确预测了引导RNA（gRNA）结构和识别靶标DNA的序列以及引发TnpB切割的TAM（Transposon-Associated Motif）序列。通过纯化其中一个典型的TnpB（命名为SisTnpB1）及其结合的gRNA核糖核蛋白复合物（RNP）进行体外核酸切割实验，发现SisTnpB1在较广的温度活性范围内（37-85℃）均具有活性，其中最适温度在65-75℃之间。

此外，SisTnpB1具有TAM依赖的切割特异性并且是Mg2+和Mn2+依赖特性。通过测序分析切割产物，发现其与Cas12家族蛋白具有相似的DNA交错切割特点，突变SisTnpB1的RuvC域的任意保守氨基酸均严重降低其切割活性。通过对靶标DNA碱基突变分析，表明靶标序列最关键的“种子”序列位于+1到+10的位置，且靶标序列+1核苷酸突变强烈抑制SisTnpB1 RNP的切割活性。此外，SisTnpB1只需一个不保守的TAM序列（5 '-WNHNN-3 '）即可用于引发靶标DNA的切割。

研究团队在细菌体内验证了SisTnpB1的靶向切割活性。通过设计靶向质粒等外源遗传元件的gRNA，SisTnpB1系统可以在细菌体内37℃条件下实现特异性切割并消除这些遗传元件。最终，该团队将SisTnpB1系统开发成为全球首个来自古菌的微型基因编辑工具，在乳酸片球菌（37和45℃）及冰岛硫化叶菌（75℃）中实现了精确的基因编辑，编辑效率>90%。研究团队申请了中国发明专利和PCT专利各一项。

鉴定全球首个来自古菌的微型编程酶性核酸酶系统SisTnpB1并开发为高效的基因编辑工具

华中农业大学生科院徐颖博士研究生为该论文第一作者，刘涛博士后为论文第二作者，彭楠教授为论文通讯作者。（来源：澎湃新闻）

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41421-023-00615-2